羊水細胞培養(yǎng)基的制備方式
更新時間：2014-09-22 點擊次數(shù)：2548
一、羊水細胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)法
1、采樣：選擇妊娠13-14周婦女，在無菌條件下抽取羊水5ml，立即注入無菌離心管中。
2、收集：離心分離細胞，1000rpm10分鐘，去上清，留0.5ml，輕打混勻。
3、接種：將混勻的羊水細胞種置于50ml或100ml細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，平均10ml羊水細胞收集的細胞種置一瓶加5-10ml混合培養(yǎng)液。
4、培養(yǎng)：酒精燈火先封口，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細胞貼臂及生長情況，5-10天后可見瓶底面有大量羊水細胞生長。
5、終止培養(yǎng)：當有大量圓形發(fā)亮細胞出現(xiàn)時，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小時。
6、細胞收集：將培養(yǎng)液倒入一干凈離心管中，加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶，輕輕搖動，使培養(yǎng)瓶底面*接觸消化酶，然后用彎頭吸管吹打，待細胞全部脫落后加前培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化。用吸管移細胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘，棄上清，留細胞沉慮。若一次消化不*，可反復(fù)消化。
7、低滲及預(yù)固定：加預(yù)溫37℃KCL溶液10ml，37℃溫育30分鐘，加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液預(yù)固定，用氣泡吹打細胞使其混勻。
8、固定：用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次，每次30分鐘。固定液加入時沿管壁緩慢加入。
9、制片及干燥：用絨毛制片。
10、分帶處理。
二、羊水細胞培養(yǎng)基蓋玻片培養(yǎng)法
1、采樣：選擇妊娠13-14周婦女，在無菌條件下抽取羊水5ml，立即注入無菌離心管中。
2、收集：離心分離細胞，1000rpm10分鐘，去上清，留0.5ml，輕打混勻。
3、接種：30mm培養(yǎng)皿中放蓋玻片1張，每片滴混勻的細胞液1-2滴，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30-60分鐘。
4、培養(yǎng)：取出后從蓋玻片外加培養(yǎng)液2ml，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細胞生殖狀況并定時換液，5-10天后，可見大量成纖維細胞或上皮樣細胞生長。
5、終止培養(yǎng)：當有大量圓形發(fā)亮細胞出現(xiàn)時，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小時。
6、低滲：倒掉培養(yǎng)液，加預(yù)溫37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃溫育30分鐘，鏡下可見脹大的羊水細胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液預(yù)固定。
7、固定：倒掉低滲液，加5ml固定液固定30分鐘以上，反復(fù)3次。
8、干燥：將附有細胞的蓋玻片斜放于培養(yǎng)皿中，置80℃烤箱處理2-3小時。
9、膠片：將附有細胞的蓋玻片用樹脂膠封固于玻片上，正面朝外，小心細胞破壞。
